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第一章 概述1

第一节 组织工程学的基本概念1

第二节 组织工程的内容及发展2

一、发展2

二、组织工程和再生医学2

三、组织工程支架材料3

四、弹性模量在促进骨再生的生物材料中的作用3

五、支架材料对拮抗细胞引发的收缩的作用4

六、添加基因的支架材料4

第三节 组织工程展望5

一、组织工程，再生医学和基因治疗所用材料的未来5

二、力学负载对细胞功能的影响5

三、组织工程的未来5

参考文献5

第二章 组织工程细胞培养基本知识7

第一节 细胞培养实验室的建立7

一、细胞培养室的功能划分7

二、细胞培养的设备和器具8

第二节 培养用液11

一、水、缓冲溶液与平衡盐溶液11

二、培养液13

三、体外培养的其他常用液16

第三节 原代培养和传代培养18

一、原代培养的过程18

二、传代培养的过程22

第四节 细胞培养的基本方法和技术23

一、二倍体细胞培养法23

二、中空纤维细胞培养技术24

三、微载体细胞培养法24

四、微囊培养技术27

第五节 培养物的冻存与复苏27

一、原理27

二、冷冻保存方法28

三、冻存细胞的复苏29

第六节 培养物的污染30

一、微生物污染的判断30

二、污染的预防31

三、污染的排除32

参考文献32

第三章 常用组织细胞的培养技术34

第一节 上皮组织的细胞培养34

一、上皮组织细胞体外生长的特殊条件34

二、表皮细胞的体外培养35

三、血管内皮细胞的体外培养37

四、食管黏膜上皮细胞的培养39

五、肠黏膜上皮细胞的培养40

第二节 结缔组织的体外培养41

一、成纤维细胞的体外培养41

二、前脂肪细胞的培养43

三、骨髓间充质干细胞的体外培养44

第三节 骨与软骨组织的体外培养45

一、成骨细胞的培养46

二、破骨细胞的培养49

三、软骨细胞的培养51

四、滑膜细胞的培养53

第四节 肌肉组织的体外培养55

一、骨骼肌细胞培养所需主要材料55

二、啮齿类动物骨骼肌细胞原代培养方法56

三、从啮齿类动物肌肉中获取高纯度肌源性细胞的方法59

第五节 神经组织的体外培养60

一、大鼠小脑皮质神经元的体外培养60

二、大鼠星形胶质细胞的体外培养62

三、大鼠雪旺细胞的体外培养64

参考文献66

第四章 应力场与细胞生长69

第一节 概述69

第二节 微重力细胞培养69

第三节 可变应力场细胞培养70

一、应力场细胞培养方法70

二、应力场对细胞结构和功能的影响71

三、应力场三维细胞培养实例73

第四节 旋转培养系统77

一、旋转培养系统及其特点77

二、旋转培养系统的分类78

三、旋转培养系统的应用范围80

四、旋转培养系统应用的局限性81

参考文献81

第五章 细胞培养与生长因子82

第一节 概述82

一、骨形成蛋白83

二、表皮生长因子83

三、成纤维细胞生长因子83

四、转化生长因子-β83

第二节 IGF-Ⅰ与细胞生长84

一、概述84

二、IGF-Ⅰ及IGF-IR的生物学功能85

第三节 bFGF与细胞生长86

一、基本概况86

二、bFGF的生物活性87

第四节 BMP与细胞生长89

一、概述89

二、BMP成熟蛋白分子结构的研究90

三、BMP的理化特性91

四、BMP与细胞生长相关的生物活性91

五、BMP的靶细胞93

第五节 TGF-β与细胞生长94

一、概述94

二、TGF-β膜受体94

三、TGF-β的生物学作用95

第六节 VEGF与细胞生长97

一、概述97

二、VEGF表达及生成的调节相关因素97

三、VEGF的生物学特性99

四、VEGF对机体的作用99

第七节 EGF与细胞生长100

一、EGF的分离纯化101

二、EGF受体与基因101

三、EGF的生物学作用101

第八节 生长因子促细胞生长的调控104

一、磷脂酶C的磷酸化及活化105

二、PKC的活化105

三、对其他活性蛋白的磷酸化和活化105

参考文献106

第六章 细胞的基因改造107

第一节 概述107

第二节 细胞寿命与细胞周期调控108

一、CDKs、cyclin、CKIs三家族108

二、细胞周期的其他调控因素109

三、正常细胞的限制点与G/S转换111

四、S期和M期的检控点112

第三节 细胞增殖寿命的延长112

一、导入病毒癌基因延长细胞寿命112

二、端粒酶与细胞寿命114

三、恶性表型的控制116

第四节 种子细胞的功能基因转染117

一、皮肤细胞功能的改造117

二、肌细胞基因改造117

三、神经细胞功能基因转染118

第五节 细胞基因改造常用技术118

一、基因转移系统118

二、端粒酶活性测定121

参考文献121

第七章 干细胞培养技术123

第一节 几种研究热点干细胞概述123

第二节 人骨髓间充质干细胞的分离培养126

一、人骨髓间充质干细胞的分离培养126

二、人骨髓间充质干细胞鉴定127

第三节 小鼠肌肉干细胞的分离培养及分化技术130

一、成肌细胞的分离培养130

二、肌肉源间充质干细胞的分离培养及鉴定131

第四节 神经干细胞的分离培养及鉴定132

一、小鼠室管膜细胞源神经干细胞的分离培养132

二、分离、培养星形胶质细胞来源的神经干细胞132

三、神经干细胞的鉴定133

第五节 造血干细胞的分离纯化、体外培养及多向分化133

一、造血干细胞的识别及分离原则133

二、免疫磁珠阳性分选法134

三、造血干/祖细胞的体外测定134

第六节 小鼠胚胎干细胞的体外培养及分化实验技术138

一、小鼠ES细胞的培养138

二、ES细胞多向分化的基本原则139

三、ES细胞向造血细胞的分化诱导技术140

四、ES培养及分化实验过程中常见的问题及处理方法141

五、ES细胞向其他细胞分化常用的诱导剂141

参考文献142

第八章 细胞形态和功能的检测技术145

第一节 概述145

第二节 细胞形态学观察145

一、活细胞培养146

二、固定染色观察法147

三、组织化学和细胞化学149

四、免疫细胞化学149

五、电子显微镜观察150

六、细胞骨架观察151

第三节 细胞生长能力检测技术152

一、细胞生长曲线的测定153

二、细胞克隆形成率测定153

三、流式细胞仪检测细胞周期和DNA合成154

第四节 细胞遗传性状检测技术155

一、细胞染色体核型分析及显带分析155

二、细胞成瘤性分析157

第五节 细胞功能检测157

一、成纤维细胞158

二、成肌细胞158

三、肌腱细胞160

四、成骨细胞160

五、破骨细胞164

六、雪旺细胞168

七、软骨细胞169

八、前脂肪细胞170

九、肝细胞170

十、口腔黏膜角化细胞171

参考文献172

第九章 细胞包埋技术174

第一节 概述174

一、细胞包埋的意义174

二、影响细胞微包囊的主要因素174

第二节 用于细胞包埋的生物材料175

一、对用于细胞包埋材料的要求175

二、天然高分子材料176

三、合成高分子材料179

第三节 细胞包埋技术181

一、细胞包埋的原理181

二、液滴的形成方法182

三、凝胶化和微包囊外膜的形成方法183

第四节 细胞包埋相关技术及其应用185

一、人工胰脏186

二、人工肝脏186

参考文献187

第十章 生长因子的控制释放技术191

第一节 生长因子191

一、概述191

二、生长因子的特性191

三、生长因子的控制释放191

四、生长因子控制释放体系191

第二节 微包囊的载体材料192

一、载体材料的分类192

二、脂质体192

三、合成高分子材料192

第三节 生长因子的控制释放技术193

一、微包囊控制释放体系193

二、水凝胶控制释放体系195

第四节 生长因子控制释放体系存在的问题195

一、生长因子的凝聚和失活195

二、生长因子的爆发释放和多阶段释放196

第五节 一些生长因子控制释放的研究197

一、碱性成纤维细胞生长因子197

二、骨形态发生蛋白197

三、转化生长因子198

四、类胰岛素生长因子199

参考文献199

第十一章 细胞示踪技术203

第一节 概述203

第二节 细胞的同位素标记和放射自显影技术203

第三节 细胞的荧光标记205

一、雪旺细胞荧光染色标记205

二、荧光标记细胞的检测和鉴定206

第四节 报告基因转染细胞用于细胞标记207

一、报告基因的选择207

二、报告基因转染207

三、筛选稳定转化细胞209

四、报告基因表达产物的分析209

第五节 其他用于组织工程研究的标记技术210

一、BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶)标记法210

二、新骨生成的四环素标记210

三、短串联重复位点检测种子细胞在体内的存活211

四、短串联重复基因的PCR-凝胶电泳检测212

参考文献213

第十二章 天然细胞外基质制备技术215

第一节 概述215

第二节 胶原215

一、胶原的结构和分类215

二、胶原的分离和提纯216

三、胶原的交联218

第三节 脱细胞真皮218

一、概述218

二、脱细胞真皮的制备219

第四节 骨基质明胶220

第五节 去细胞、去基质骨221

一、煅烧骨的制备221

二、生物衍生骨的制备222

第六节 去细胞、去抗原周围神经222

一、概述222

二、去细胞、去抗原神经的制作方法223

第七节 去细胞、去抗原肌腱224

一、概述224

二、鼠尾肌腱的处理224

三、生物衍生人肌腱支架材料的制备224

第八节 小肠黏膜下基质225

一、概述225

二、小肠黏膜下基质的制备225

第九节 其他脱细胞脱抗原基质的制备227

一、脱细胞猪主动脉瓣的制备227

二、脱细胞猪主动脉血管基质的制备227

参考文献228

第十三章 人工合成的细胞外基质230

第一节 概述230

一、人工细胞外基质230

二、人工细胞外基质的设计230

第二节 羟基磷灰石232

一、HA的制备233

二、HA特性234

第三节 生物活性玻璃和玻璃陶瓷235

一、生物活性玻璃和玻璃陶瓷235

二、生物活性玻璃(陶瓷)与骨整合235

三、BGC表面似骨磷灰石形成235

四、BGC的力学性能236

五、生物活性玻璃237

六、生物活性玻璃陶瓷A-W238

第四节 HA/β-TCP238

一、磷酸三钙(TCP)238

二、双相磷酸钙(BCP)238

第五节 PLA、PGA与PLGA239

一、PLA239

二、PGA241

三、PLGA241

参考文献242

第十四章 复合型人工细胞外基质243

第一节 概述243

第二节 PLA与HA复合243

一、固液相分离技术243

二、压制成型244

三、锻塑成型245

四、仿生过程246

第三节 HA与胶原复合246

一、共沉淀HA原位复合胶原246

二、胶原基材生物矿化247

第四节 HA与生长因子复合247

一、BMP载体——控制释放和细胞分化因子247

二、BMP/微晶HA248

参考文献248

第十五章 细胞与细胞外基质的联合培养技术250

第一节 概述250

第二节 种子细胞与支架材料的接种250

一、细胞接种前的准备250

二、细胞与支架的接种技术251

第三节 影响细胞与支架材料复合的因素253

一、支架材料的影响253

二、细胞的影响254

三、培养方法的影响255

四、应力应变的影响256

参考文献256

第十六章 动物体内植入技术258

第一节 概述258

一、实验动物分类258

二、实验动物的选择259

三、动物实验设计的注意事项262

第二节 组织工程化组织的体内植入技术263

一、组织工程骨体内植入263

二、组织工程软骨体内植入技术264

三、组织工程肌腱植入技术266

四、组织工程周围神经体内植入技术267

五、组织工程皮肤体内植入技术267

第三节 体内植入物的标记及取材268

一、移植物的标记268

二、移植物的取材269

参考文献270

第十七章 组织工程化组织动物体内植入的检测技术271

第一节 概述271

第二节 大体观察272

一、对动物个体的观察272

二、对局部组织及植入物的观察272

第三节 组织学检查273

一、软组织的组织学检查273

二、硬组织材料的组织学检查276

第四节 免疫组织化学检查278

一、免疫组织化学检查的一般原则278

二、Ⅰ型胶原染色278

三、Ⅱ型胶原染色279

第五节 原位杂交检查280

一、原位杂交检查在组织工程研究中的应用280

二、原位杂交检查的方法280

第六节 超显微结构观察282

一、扫描电子显微镜282

二、透射电子显微镜282

第七节 血循环观察283

一、动态观察283

二、静态观察283

第八节 影像学检查283

一、超声波检查284

二、X线检查284

三、CT检查和MRI检查284

第九节 电生理检查285

一、电生理检查仪的基本构成部分285

二、电生理检查在组织工程研究中的应用286

三、动物电生理检查的一般原则和操作步骤286

四、运动神经传导检查方法287

五、感觉神经传导检查方法288

六、混合神经传导检查方法289

第十节 免疫学检查和生化检查290

一、免疫学检查290

二、生化分析291

参考文献300

第十八章 组织工程的分子生物学技术301

第一节 组织工程的分子克隆技术301

一、分子克隆的概念及其在组织工程中的意义301

二、分子克隆的技术要点301

三、基因克隆实例介绍304

第二节 基因转染技术311

一、常用基因转染技术的分类311

二、常用基因转染技术的操作规程313

第三节 功能基因的表达与调控316

一、表达载体的组成元件317

二、常用的哺乳动物细胞表达载体及其特点317

第十九章 组织工程化组织的临床应用技术322

第一节 概述322

一、组织工程化组织形成的主要技术路线322

二、临床应用的基本条件322

第二节 组织工程骨的临床应用325

一、种子细胞的选择325

二、支架材料的选择326

三、细胞与支架材料的联合培养326

四、手术方法326

五、结果327

六、手术适应证及禁忌证327

第三节 组织工程肌腱的临床应用328

一、种子细胞的选择328

二、支架材料的选择329

三、细胞与支架材料的联合培养330

四、手术方法330

五、结果331

六、手术适应证及禁忌证331

第四节 其他组织工程化组织的临床应用331

一、组织工程软骨的临床应用331

二、组织工程皮肤的临床应用332

三、其他组织工程化组织的临床应用332

第五节 组织工程临床应用的检测技术332

一、一般检查333

二、化验检查333

三、免疫学检查333

四、影像学检测333

五、活体组织检查334

六、基因检测334

七、功能检测335

参考文献335

第二十章 组织工程展望337

第一节 概述337

一、种子细胞的研究进展337

二、支架材料的研究进展338

三、组织构建研究进展339

四、组织工程的临床应用340

第二节 组织工程尚需研究的科学问题341

一、种子细胞的进一步研究341

二、支架材料的研究343

三、细胞与支架材料的相互作用343

四、动物体内植入试验343

五、临床验证研究343

六、检测及评价344

七、产业化研究344

第三节 展望344

一、巨大的病人需求344

二、政府的重视345

三、企业介入345

参考文献345

中西文名词对照347